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武漢貝科新肽-慢病毒載體構(gòu)建

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為什么有的共定位圖片中葉綠體通道是玫紅色？

在擬南芥、、玉米、大麥、小麥等材料中，慢病毒載體構(gòu)建，種植培養(yǎng)苗子時(shí)是正常接受光照的，葉片中含有大量葉綠體，而葉綠素在640nm左右的激發(fā)光下可產(chǎn)生紅色的自發(fā)熒光。當(dāng)在這些含葉綠體較多的受體材料中做共定位實(shí)驗(yàn)時(shí)，共定位marker一般為紅色熒光（在560nm左右的激發(fā)光下），實(shí)驗(yàn)及共聚焦拍攝時(shí)兩個(gè)波長(zhǎng)通道的熒光互不影響，但視野下看著比較混淆，尤其疊加后二者不易分清，因此只是在顏色顯示上將葉綠體自發(fā)熒光設(shè)置為玫紅色，以顯示和共定位marker的區(qū)別。

亞細(xì)胞定位操作步驟

1、通過一些在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位

2、亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建

（1）引物設(shè)計(jì)：利用引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)pEGP-MCS-N1或pEGP-C1-MCS的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)目的基因引物。

（2）載體構(gòu)建：將PCR產(chǎn)物酶切后插入pEGP-MCS-N1或pEF-C1-MCS，得到表達(dá)目的基因與EGP融合蛋白質(zhì)的真核表達(dá)載體。

3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，接種到共聚焦顯微鏡的玻璃底培養(yǎng)皿（35mm petri dish，10 mm Microwell）中，培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到30%~50%時(shí)，將融合綠色熒光蛋白GFP的重組載體質(zhì)粒和目標(biāo)細(xì)胞器質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。37℃孵箱培養(yǎng)24~72h。

4、激光掃描共聚焦顯微鏡觀察

將上述細(xì)胞分別在24、36、48、72h的時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇對(duì)應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)（常用405nm、488nm和561nm），使用共聚焦顯微鏡觀察，采取圖像。

原理簡(jiǎn)介

GFP、RFP等熒光蛋白因其的熒光性質(zhì)和靈敏性，常作為報(bào)告基因研究并分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位和相互作用等。將目標(biāo)蛋白與熒光蛋白的N端或者C端融合，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)或穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，使得該融合蛋白在受體材料細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，目標(biāo)蛋白會(huì)牽引熒光蛋白一起定位到目標(biāo)細(xì)胞器，通過顯微鏡觀察熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)顯示的位置，確定目標(biāo)蛋白的位置，從而確定目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

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